南宫28官网,南宫28官方网站,南宫28APP下载双抗结构复杂，分子量较单抗可大可小，目前披露的双抗结构很多，有含 Fc 的，有不含 Fc 的，有对称的，也有不对称的。还有些是对 Fc 进行突变，降低错配的设计。具体如下图所示。

　　双抗结构的独特性及作用机制的区别，对PK/PD研究、分析方法开发、结构-功能研究等提出了很大挑战。比如靶点介导的药物消除，双抗相当于多了一个变量，受两个靶点表达的细胞类型、表达丰度等多重影响。又如可溶性靶点对PK的影响，双抗也多了一个影响因素，增加了游离药物和总药物浓度检测的难度和复杂性。双抗检测成分大致分为三类：完整分子检测、功能区域检测和总分子检测。

　　双抗检测的核心目的是仅测定活性双抗分子，即功能性区域未脱落，也未被ADA或循环的靶点阻断。检测完整双特异性分子是目前最常见的一种选择。如下图所示的检测模式，可以用两个靶点的重组蛋白、或两个抗独特型抗体、或靶点蛋白和抗体的组合。

　　除了免疫学方法，也有用LC-MS质谱法检测完整分子的案例。大致过程是先用靶点蛋白或抗独特型抗体将游离的双抗从样品中分离，再用LC-MS进行分析，这样检测到的也是游离药物浓度。当然，有些双抗给药剂量很低，对灵敏度的要求高，质谱法较免疫学方法就会有些劣势。

　　所谓功能区域检测，就是针对单一特定功能区域浓度的检测。功能检测的目的是为了确认双功能分子的哪个功能区是有活性的。因为双抗发生生物转化或者被ADA阻断后有可能丧失某一功能区的活性。如下图所示，可以采用单一功能区的靶点蛋白或针对该抗体片段的独特性抗体，与抗Fc或框架区抗体组合检测。

　　总分子检测自然是把所有形式的可溶性分子均包含在内。无论该分子是否已经在体内发生结构或功能的改变。以含Fc双抗为例，如下图所示，可以采用针对Fc不同表位的抗体进行组合检测。

　　CDE，2017，《双特异性抗体药物非临床研究的考虑要点》：双特异性抗体，例如DVDs ( Dual-variable domains)，可以看作是具有双倍抗原结合结构域的抗体，并且2个结合位点对各自的靶点是有活性的，所以需2个专用的药动学试验来满足分析任务，2 个试验的结合结构域都与靶点结合。因此，双特异性抗体需要双倍的生物分析工作量。为了改善这一状况，有研究者采用“嵌合设计”用于PK 试验。嵌合设计的原理是使用2个靶点( 配体A 和B) 进行试验设计，2个靶点配体都参与PK 试验。与配体A 既用于捕获也用于读取结果的方法相比，嵌合法中配体A 用于捕获，配体B 用于读取结果，或相反。

　　CDE的观点，简言之就是可以开发两种方法，类似于前文介绍的功能区域检测，对两个功能区域分别检测。也可以开发一个方法，用两个配体分别进行捕获、检测。当然，把配体更换为抗独特型抗体的效果应该是一样的。

　　Emicizumab，商品名Hemlibra，2017年获批，用于A型血友病的治疗。Emicizumab由凝血因子IXa和X组合而成。结构如下图所示。

　　Emicizumab临床PK检测方法采用的ELISA，样本基质为人血浆。检测原理为双抗体夹心，用到的是两个针对靶向Emicizumab结合位点的独特型抗体。先将捕获抗体rAJ540-rbtIgG包被在高结合板上，之后加检测抗体rAQ8-mIgG2b，最后用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体进行检测。标曲范围100-6400ng/mL。

　　Amivantamab，商品名Rybrevant，是一种靶向EGFR耐药突变、MET突变和扩增的双特异性抗体，可以同时结合EGFR和c-Met的胞外结构，阻断配体与EGFR和MET的结合，促进受体降解，还可触发抗体依赖性细胞毒性。2021年获批上市用于特定突变的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗。结构如下图所示。

　　Amivantamab临床PK检测方法采用的MSD公司的电化学发光法。样本基质为人血清。检测原理为双配体夹心。先将人biotin-EGFR-Fc与SulfoTag- cMET Fc添加到标曲或样品中，充分混合，之后转移到链霉亲和素包被的MSD板子上进行检测。标曲范围320-40960ng/mL。

　　Tebentafusp，商品名Kimmtrak，是Immunocore公司开发的一种新型双特异性蛋白，由靶向gp100（黑色素瘤相关抗原）的高亲和力T细胞受体（TCR）和抗CD3 抗体组成（如下图所示），使T细胞重新定位以杀伤表达gp100的肿瘤细胞。本品于2022年获批上市用于不可切除或转移性葡萄膜黑色素瘤。

　　Tebentafusp临床PK检测方法也是基于MSD平台的电化学发光法。样本基质为人的血清。检测大致步骤是，首先用biotin标记的HLA‐A2 gp100抗原进行捕获，之后加入兔抗gp100 TCR抗体，检测抗体用的SULFO‐TAG偶联的羊抗兔抗体。与前两个案例不同的是，Tebentafusp检测的是TCR单功能区域。未对anti-CD3 scFv进行检测。标曲范围25-5000pg/mL。

　　Mosunetuzumab，商品名Lunsumio，是罗氏开发的一款CD20/CD3 T细胞连接的双特异性抗体，旨在靶向B细胞表面的CD20和T细胞表面的CD3。2022年获批上市用于治疗复发或难治性滤泡性淋巴瘤。结构如下图所示。

　　Mosunetuzumab临床PK方法采用的ELISA，样品基质为人血清。检测原理为双抗体夹心，捕获抗体采用的抗anti-CD20 arm的独特型抗体，检测抗体采用的biotin标记的抗anti-CD3 arm独特型抗体。标曲范围10-500ng/mL。

　　Epcoritamab，商品名Epkinly，是基于Genmab公司专有技术构建的IgG1亚型双特异性抗体，可同时结合T细胞上的CD3和B细胞上的CD20，并诱导T细胞介导的CD20阳性细胞的杀伤。2023年获批用于复发或难治性弥漫大B细胞淋巴瘤。

　　Epcoritamab开发了两种PK检测方法，分别基于荧光和电化学发光。检测基质为人血浆。如下图所示，两个方法用于夹心的抗体是一样的，均采用的针对Epcoritamab结合CD20和CD3两个臂的独特型抗体。其中，荧光法的标曲范围为60-500pg/mL，电化学发光法为10-1000pg/mL。

　　Glofitamab，商品名为Columvi，是由基因泰克开发的CD20/CD3双特异性抗体。该双抗具有创新的2:1结构形式，包含靶向T细胞表面CD3蛋白的一个蛋白域和与B细胞表面CD20蛋白结合的两个蛋白域，如下图所示。2023年获批上市用于经两线或多线系统治疗后的成人患者的复发或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤，或由滤泡性淋巴瘤引起的大B细胞淋巴瘤。

　　Glofitamab临床PK方法采用的ELISA，样品基质为人血清。检测方法为两步ELISA。第一步先将生物素标记的抗CD3结合区域的抗体包被在SA板子上，孵育1小时，洗板3次后，加入标曲样品或待检测样品，之后孵育35分钟，洗板3次。再加入针对CD3结合区域另外一个不同表位的地高辛标记的抗体，孵育2.5小时。第二步将第一块板子中形成的复合物转移到第二块铺有SA标记的针对CD20结合结构域的抗体的板子内，孵育35分钟，洗板3次，之后加入针对地高辛的检测试剂。标曲范围为0.625-40ng/mL。

　　可以看出Glofitamab的PK检测方法还是比较特别的，用了3种不同的抗体、2块板子进行样品处理。这么处理的核心原因是通过2.5h的地高辛标记抗体的孵育，让结合的Glofitamab充分释放。

　　已上市的6款双抗PK检测方法总结如下，检测基质有血浆也有血清，检测方法一半用的传统ELISA，一半用的ECL电化学发光法。大部分检测组分为完整的双特异分子，只有Tebentafusp检测的是单功能区域。

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